Rekrutierung neuraler Stammzellen in einen regenerativen Phänotyp durch regenerierendes Gewebe des Axolotl-Salamanders
Gegenstand
Axolotl Schwanzlurche (Ambystoma mexicanum) sind in der Lage amputierte Gliedmaßen, Organe und sogar Teile des Hirns vollständig zu regenerieren. Die Regenerate sind dabei strukturell und funktionell vollständig intakte Organe. Dazu gehört auch ein funktionstüchtiges Rückenmark nach einer Schwanzflossenamputation.
Initial kommt es zur Bildung einer mesenchymalen Gewebeknospe, welche man als Blastema bezeichnet. Dieses Gewebe präsentiert sich als dedifferenzierte Zellpopulation und entwickelt sich zu einer frühembryonalen Anlage der Schwanzflosse mit einer tubenartigen, ependymalen Vorläuferstruktur des dazugehörigen Rückenmarkes. Die Entwicklung zum reifen Gewebe bzw. Organ erfolgt im Rahmen eines komplexen Prozesses durch Proliferation, Differenzierung und morphogenetische Zellbewegungen.
Während dieses Vorganges erfolgt die Expression spezifischer Zelldifferenzierungs- und -adhäsionsmoleküle, sowie die Sekretion parakriner und autokriner Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, mit welchen sich die ansässigen Progenitorzellen wechselseitig beeinflussen.
Methoden
Ziel der Untersuchungen war es, nachzuweisen, welchen Effekt das regenerative Milieu des Blastemagewebes auf das Verhalten von Säugetierstammzellen hat.
Dazu wurde eine Kultur von murinen neuronalen Stammzellen verwendet, welche unter definierten Kulturbedingungen zur Ausbildung von 3D Neurosphäroiden führt. Diese Sphäroide wurden in Form einer ‘in vitro‘ Gewebekonfrontation mit dem regenerativen Blastema kokultiviert, welches ca. 10 Tage nach der Amputation des Axolotlschwanzes gewonnen wurde. Die Sphäroide wurden dabei unmittelbar neben dem Blastemgewebe positioniert, 3-7 Tage inkubiert, schließlich fixiert und analysiert. Zunächst wurde das Invasions- bzw. Migrationsverhalten der NSC-Zellen anhand konfokaler Schnittbildmikroskopie untersucht. Anschließend wurde das Proliferations- und Differenzierungsverhalten der NSC-Zellen mit Hilfe immunhistochemischer Färbemethoden analysiert. Dabei wurden Anikörper gegen Nestin, GFAP, Tubulin, NeuN, CNPase, Ki67, sowie BrdU verwendet und anhand von Fluoreszenzmikroskopie bzw. Konfokalmikroskop qualitativ und quantitativ ausgewertet.
Resultate
Es zeigte sich, dass NSC-Zellen in der Lage sind, sich im Rahmen der Konfrontation gegen Blastemagewebe aus dem Shäroidverband zu lösen und vollständig in das benachbarte regenerative Gewebe zu migrieren. Die Identifikation dieser Zellen gelang im Rahmen der Immunfluoreszenz anhand des BrdU, welches die Zellen während der Teilung in die DNA aufnehmen, und eines spezifischen BrdU-Antikörpers. Dabei zeigte sich ein vermindertes Proliferationsverhalten im Bereich der Kontaktfläche zum Blastem.
Weiterhin sahen wir eine Abnahme der Expression der frühneuronalen Marker Nestin und GFAP, sowie einen leichten Signalanstieg des neuronalen Markers Tubulin bei den NSC-Zellen. Das Blastemgewebe reagierte im Rahmen der Konfrontation mit den Stammzellen mit einer Zunahme der Expression des kernständigen Neuronenmarkers NeuN und des Oligodendrozytenmarkers CNPase.
Zusammenfassung
Zusammenfassend lässt sich behaupten, dass es im Rahmen der Kokultivierung von murinen neuronalen Stammzellen und regenerativem Blastemagewebe zu einer Induktion von Differenzierungsprozessen kommt, in welche sowohl die NSC-Zellen, als auch die Zellen des Blastemagewebes eingebunden sind.
Es zeigte sich eine deutliche Abnahme der Proliferationsrate und eine merkliche neuronale bzw. oligodendrogliale Differenzierung in den NSC. Das kokultivierte Blastemgewebe zeigte ebenso eine neurale und oligoastrozytäre Ausdifferenzierung.
Man kann daher eine wechselseitige Beeinflussung hinsichtlich dieser komplexen regenerativen Mechanismen postulieren.
Die dabei relevanten, wechselseitig wirkenden Faktoren werden Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.