Benutzerspezifische Werkzeuge

Projekte

Degeneration und Regeneration nach Schädigung des Rückenmarks

Bei einer Verletzung des Rückenmarks kommt es zur Unterbrechung von Nervenbahnen sowie zu ausgeprägten Gewebeveränderungen. Gliazellen hypertrophieren und bilden eine Narbenstruktur um die geschädigte Region aus. Mikrogliazellen, die Immunzellen des Nervensystems, werden aktiviert und bei Beschädigung der Dura kommt es zur Anreicherung von Fibroblasten.

Wir konnten zeigen, dass schwingungspektroskopische Untersuchungen Rückenmarksläsionen aufgrund veränderter Gewebeeigenschaften identifizieren und Auskunft über die Stärke der Schädigung (Größe und Qualität) geben können. Diese Techniken sollen dazu genutzt werden, in Zukunft degenerative Veränderungen nach Rückenmarksläsion zu bewerten und regenerative Prozesse, z. B. bei der Erprobung neuer Therapien zu überwachen.

Rückenmark

Nach Schädigung des Rückenmarks können diese Veränderungen ohne Färbung oder Markierung durch nicht-lineare Techniken visualisiert werden: Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) bildet die Verteilung des Myelins von intakten Nervenbahnen ab und zeigt im geschädigten Rückenmark Regionen mit Demyelinisierung auf. Second Harmonic Generation (SHG) identifiziert Kollagen als Bestandteil der fibrösen Narbe. Das Ausmaß der Entzündungsreaktion kann durch die Eigenfluoreszenz der aktivierten Mikrogliazellen und Makrophagen (Two photon excited fluorescence, TPEF) abgeschätzt werden. Ungefärbte Dünnschnittpräperate des läsionierten Rückenmarks (Ratte) wurden mit CARS-Mikroskopie (abgestimmt auf die CH2-Bindungsschwingung Lipidreiche Bereiche (weiße Substanz) erscheinen hell, dunkle Bereiche zeigen lipidarme Areale an.) untersucht. Die räumliche Auflösung und Darstellung morphologischer Details sind mit denen von histologischen Färbungen vergleichbar (H&E-Färbung eines Folgeschnittes).

H&E-Färbung

Ungefärbte Dünnschnittpräparate eines Rückenmarks mit Läsion wurden mit FT-IR untersucht, als Referenz dient ein H&E gefärbter angrenzender Schnitt. Ausschließlich basierend auf den Infrarotspektren können durch einen Klassifizierungsalgorithmus die unterschiedlichen Bereiche im Rückenmark unterschieden und der Läsionsbereich identifiziert werden.

 #Seitenanfang

CARS-Imaging am Modell des regenerierenden Rückenmarks im Axolotlsalamander

Eine Rückenmarksverletzung stellt einen dramatischen Einschnitt im Leben des Betroffenen dar.
Trotz technischer Fortschritte in der operativen Behandlung  traumatischer Schäden des Nervensystems ist die Fähigkeit zur Wiedererlangung vollständiger motorischer Funktionalität begrenzt. Dies ist beim Menschen primär bedingt durch ein eingeschränktes Potential zur Regeneration neuronaler Strukturen und der Ausbildung einer regenerationsfeindlichen Glianarbe im Bereich der Läsion.
Aktuell besteht der Wunsch nach einem bildgebenden Verfahren, um sowohl im experimentellen, als auch im klinischen Setting das Schadensausmaß der Verletzung, als auch den eventuellen Nutzen verschiedener Therapieansätze untersuchen zu können. Bisher ist der bildmorphologische Nachweis einer erfolgreichen oder fehlenden Regeneration beschränkt auf langwierige Färbemethoden, die jedoch keine Möglichkeit der in-vivo Anwendung bieten. Mit der CARS-Methode sind wir nun erstmalig in der Lage den Regenerationsprozess am Beispiel des verletzten Rückenmarks des Axolotls, welches allgemeinhin als Referenzmodell für eine optimale Regeneration dient, färbefrei darstellen zu können. Verbunden mit der hohen Aufnahmegeschwindigkeit bietet sich uns darüber hinaus die Möglichkeit in situ am lebenden Gewebe  die strukturelle Reorganisation nach Rückenmarkstrauma live verfolgen zu können.

CARS imaging

CARS Bildgebung des läsionierten Rückenmarks des Axolotls zeigt die Unterbrechung der Nervenfasern. Das CARS Signal ist in exakter Übereinstimmung mit der immunhistochemischen Färbung für Myelin.


peripherer Nerv

Vergleichende Abbildungen eines peripheren Nerven mit umgebenden Strukturen in der unteren Extremität des Axolotls.
(A), (B), (C) Unterschiedliche Vergrößerungen des Nerven, die durch nichtlineare optische Verfahren über ein Multiphotonenmikroskop akquiriert wurden. Das CARS-Signal (rot) steht hierbei stellvertretend für die Myelinscheiden der einzelnen Axone (vergrößert in C), das SHG-Signal für Kollagenbestandteile, und TPEF stammt von endogenen Fluorophoren aus Zellplasma und der extrazellulären Matrix. (D) Immunfluoreszenz zur histologischen Darstellung des MyelinstrukturproteinMBP(myelin basic protein).

   #Seitenanfang

Toxizitätsuntersuchungen

Für die angestrebte Anwendung der markierungsfreien und schnellen CARS-Bildgebung bei der Diagnose und Therapie von humanen Hirntumoren ist es unerlässlich, Toxizitätsuntersuchungen durchzuführen. Potentiell könnte es zu einer Zellschädigung durch die Bestrahlung mit den Anregungslasern kommen, auch wenn es bisher dafür keine Hinweise gibt.
Eine Erhöhung der endogenen Fluoreszenz wurde als intrinsischer Marker  für eine phototoxische Schädigung in Zellen und Geweben sowohl wie in vivo etabliert. Messparameter, welche eine schädigungsfreie Analyse von Zellen und Geweben erlauben können mit Hilfe dieses Markers an ex vivo Präparationen bestimmt werden. So ermöglicht eine Verringerung der Laserleistung z. B. eine höhere Expositionszeit und längere Beobachtungsdauer.

Toxizitätsuntersuchung

Gewebeschnitte des Maushirns wurden wiederholt mit ps-Lasern, wie sie für die CARS-Bildgebung verwendet werden, bestrahlt. Zunächst ist keinerlei Veränderung des Gewebes feststellbar, doch nach 400 Expositionen wird eine phototoxische Schädigung des Gewebes durch den Anstieg der endogenen Fluoreszenz (grün) sichtbar. Durch eine Reduktion der Laserleistung auf 50 % kann die Schwelle für eine phototoxische Schädigung deutlich erhöht werden.

  #Seitenanfang

Untersuchung von Hirntumoren (Tiermodell)

Neben der Untersuchung von Schnittpräparaten sind Raman Spektroskopie und CARS auch in vivo einsetzbar.
Schwingungspektroskopische Techniken liefern schnell, färbe- und markierungsfrei sowie objektiv Informationen über die Zusammensetzung von Zellen und Geweben. Sie können zur Differenzierung von gesundem und malignem Gewebe genutzt werden.
Die intraoperative Anwendung dieser Methoden während der Resektion von Hirntumoren könnte zu einer Verbesserung bestehender Operationstechniken beitragen. Neben der klassischen histopathologischen Schnellschnittdiagnostik könnten spektroskopische Untersuchungen des Gehirns in Echtzeit Informationen über Größe und Art des Tumors liefern. Im Mausmodell konnte bereits gezeigt werden, dass der Einsatz von Raman-Spektroskopie in vivo die korrekte Identifikation von Hirntumoren ermöglicht.

Eine Maus mit zerebraler Melanommetastase wurde mit Raman-Spektroskopie in vivo untersucht.
Oben: Die Metastase ist als dunkler Bereich im Cortex nahe der Mittellinie gut zu erkennen (Pfeil).
Nach Raman-mapping des Tumorbereichs kann durch Clusteranalyse der Tumor identifiziert werden.
Im Falschfarbenbild (unten links) repräsentieren gelb, blau und türkis dargestellte Cluster Normalgewebe, rote die Mittellinie und grau sowie schwarze Bereiche den Tumor.
Die Überlagerung mit dem exponierten Hirn bestätigt die Übereinstimmung der Clusteranalyse mit der Hirnanatomie und der Position der Metastase (aus: Kirsch et al., 2010).
Maus Melanom-MET 

 #Seitenanfang

Untersuchung von humanen Hirntumoren

 In Dresden besteht ein weltweit einzigartiger Aufbau durch die Installation eines FTIR-Spektrometers im OP-Saal. Neu ist ein mobiles ATR FT-IR Gerät, mit dem frische Tumorproben untersucht werden können. Die Biopsieproben werden im Rahmen von regulären Tumorresektionen entnommen und direkt im Anschluss (innerhalb von Minuten nach Entnahme) mit ATR FT-IR Spektroskopie untersucht. Die registrierten Spektren geben Aufschluss über die biochemischen Bestandteile der Probe. Diese Methodik ist potentiell dafür geeignet, innerhalb kürzester Zeit während der Operation diagnostische Informationen für den Operateur zu liefern.
Erstmalig kann an unserem Standort eine prospektive Untersuchung zur intraoperativen spektroskopischen Klassifizierung durchgeführt werden.

 

 

 

 

Weiterhin werden humane Hirntumorbiopsien färbe- und schädigungsfrei mittels Multiphotonen-Mikroskopie untersucht.

Multiphotonen-Mikroskopie










Färbefreie Analyse eines Riesenzellglioblastoms.

Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS), endogene Fluoreszenz (TPEF) und Second Harmonic Generation (SHG) zeigen die morphochemische Gewebestruktur mit hoher räumlicher Auflösung.
Gewebestruktur

 #Seitenanfang

Identifizierung von Tumorstammzellen

Die Entdeckung von Stammzellen in Gliomen, den häufigsten primären Hirntumoren bei Erwachsenen, hat zur Entwicklung von neuen Konzepten bezüglich Tumorentstehung und -wachstum geführt. Das Auftreten von Rezidiven und Therapieresistenzen gegenüber Chemotherapeutika werden auf das Vorhandensein dieser Tumorstammzellpopulation zurückgeführt. Bei der Entwicklung neuartiger Therapieansätze müssen daher gezielt Tumorstammzellen ausgeschaltet werden.
Stammzellen zeichnen sich durch spezielle zellbiologische Eigenschaften aus und können durch spezifische Marker (z. B. CD133) charakterisiert werden. Die Ausbildung dieser Eigenschaften erfordert ein spezifisches biochemisches Korrelat. Dieses spezifische biochemische Profil kann durch optische Methoden der Schwingungsspektroskopie charakterisiert werden. Es ist besonders hervorzuheben, dass keine Vorbehandlung, z. B. Anfärbung der Probe notwendig ist und nicht nur einzelne, spezielle Marker untersucht werden, sondern das gesamte biochemische Profil einer Probe abgebildet und analysiert werden kann.
In diesem Projekt sollen Tumorstammzellen zunächst in Zellkultursystemen mit schwingungsspektros-kopischen Methoden identifiziert werden.
Aus diesem Datensatz soll eine spektroskopische Tumorstammzellsignatur extrahiert werden.
Nachfolgend soll im Tiermodell überprüft werden, ob auch im Gewebeverband Tumorstammzellen lokalisiert werden können. 

Immuncytochemische Färbung
--------------------------------------------------------------------
         rot - Stammzellmarker (CD133) und
helblau - Zellkerne (DAPI)

Kultivierte Gliomzelllinien exprimieren den Stammzellmarker CD133. Der Anteil der Tumorstammzellen variiert zwischen den verschiedenen Zelllinien und wird durch Differenzierungsprozesse beeinflusst.


immuncytochemische Färbung

 Gliomzelllinien

Mittels Clusteranalyse werden die spektralen Datensätze nativer Gliomzelllinien analysiert. Infrarotspektren von Gliomzelllinien mit hohem Anteil an Tumorstammzellen werden dabei einem anderen Cluster zugeordnet als Spektren von Zelllinien mit einem geringen Anteil. Die entsprechenden Centroidspektren zeigen Unterschiede in spektralen Regionen, welche Kohlenhydraten und RNA/DNA zugeordnet werden können.
    #Seitenanfang

 Identifizierung verschiedener Zelltypen

Das Nervensystem besteht aus unterschiedlichen Zelltypen: Neurone sind für die Signalverarbeitung und -weiterleitung verantwortlich, verschiedene spezialisierte Gliazellen besitzen trophische und modulatorische Funktionen.
Die Unterscheidung zwischen verschiedenen Zelltypen oder -populationen erfordert bisher eine Markierung spezifischer Zellbestandteile. Diese wird anschließend visualisiert, z. B. mittels immunzytochemischer Methoden.
In diesem Projekt sollen verschiedene Zelltypen mit Hilfe von Schwingungspektroskopie Identifiziert werden. Jeder Zelltyp oder sogar jede Zellpopulation besitzt eine eigene Physiologie und Morphologie, die aufgrund spezifischer biochemischer Komponenten entsteht.
Solche Unterschiede in der chemischen Zusammensetzung bzw. Unterschiede im Gehalt von Biomolekülen können mit spektroskopischen Methoden aufgelöst werden. Nach aufwändiger statistischer Berechnung durch die Anwendung von Klassifizierungsalgorithmen können Zelltypen mit hoher Genauigkeit identifiziert werden.


Humane Gliomzelllinien (U343, T1115, T508) können mit Infrarotspektroskopie unterschieden werden: Gliomzelllinien1

(aus: Steiner et al., 2008).

  
#Seitenanfang